细胞融合技术在生物医疗领域中扮演着重要角色，常用的方法包括物理法（如电融合、激光融合）、化学融合法和生物融合法等。化学融合法中的聚乙二醇（PEG）融合法，是一种较为常见且有效的细胞融合方式。

聚乙二醇（PEG）根据分子量的不同，呈现不同的形态。分子量在200至700之间时，它通常是一种无色、无臭的粘稠液体；而分子量大于1000时，则呈现乳白色的蜡状固体。PEG具有良好的水溶性，并可以溶于乙醇及多种有机溶剂，此外，其化学稳定性较强，对许多化合物也不具反应性。在细胞融合中，常选用分子量为4000的PEG，通常浓度为50%，pH范围在80至82（可用10% NaHCO₃进行调整）。需要注意的是，分子量较小的PEG融合效果较差且存在毒性，而分子量过大的PEG则过于粘稠，增加操作难度。经研究发现，50%的PEG在碱性条件下具有最佳的融合效果，且可以与10%二甲亚砜联合使用。此外，不同批次的PEG即便其分子量相同，融合率也可能存在显著差异，因此选用时需谨慎。同时，每批次的PEG在使用前都应进行细胞毒性测试，确保其安全性，推荐优先选择用于气相色谱的高纯度PEG。

在细胞融合的具体操作中，常用的融合方法包括转动法和离心法。脾细胞和骨髓瘤细胞的比例通常为1:1至10:1，3:1或5:1的比例使用最为广泛。

实验材料准备

1. 用于融合的脾细胞和骨髓瘤细胞。

2. 1640培养液100ml。

3. 完全1640液100ml。

4. 25% FCS-1640液50ml。

5. HAT培养液100ml。

6. 50% PEG: 将10g分子量4000的高纯度PEG（如日本进口或Serva）放入25ml的瓶中进行高压灭菌，使用前与预热至40℃的1640液10ml等量混合，检查pH值。如果pH值发生变化，可用HCl或NaHCO₃进行调整。

7. 10ml和50ml的灭菌沉淀管或瓶。

8. 40孔塑料培养盘。

操作步骤

1. 准备好脾细胞。

2. 在50ml沉淀管中混合108脾细胞与107小鼠骨髓瘤细胞，加入50ml的25% FCS-1640液。

3. 在室温下进行400g离心3分钟，使细胞沉淀。

4. 移去上清液。

5. 轻敲管底部使沉淀流动，将沉淀管放置于40℃水浴中，以达到融合温度。

6. 添加预热至40℃的50% PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，同时轻轻摇动沉淀管，观察到呈现颗粒状态，滴加过程持续2分钟。

7. 加入1ml 1640液，边加边摇动1分钟。

8. 重复步骤7一次。

9. 在此过程中，再加入1ml 1640液，边加边摇动，持续0.5分钟。

10. 再次重复步骤9一次。

11. 加入15ml 1640液。

12. 在室温下，以400g离心1分钟使细胞沉淀。

13. 去除上清液，轻敲管底部，加入25ml含有HAT的完全1640液。

14. 将融合的细胞液以每孔1滴（约0.05ml）的量，滴加到前一天培养过细胞的40孔塑料培养盘中。

15. 轻轻摇动后，放入5% CO₂饱和湿度37℃温箱中培养。

16. 在第3、6、9和10天更换为含HAT的完全1640培养液。请注意，轻轻吸取上清液，避免吸出固定于孔底的细胞，根据需要适量添加饲养细胞。

17. 在第12和15天再次加入含HAT的完全1640培养液。在每次换液前，用倒置显微镜观察，大约在10天左右可观察到杂交瘤细胞的生长。大多数杂交瘤细胞会在10至20天内出现，少数可能需要一个月左右。

18. 一旦杂交瘤细胞出现后，吸取上清液进行抗体检查。

19. 对继续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。在传代过程中，可以根据情况逐渐去掉HAT液和完全1640液，改为10% FCS-1640液。同时，对细胞进行液氮保存和克隆化，以确保每代都检查抗体，避免抗体细胞的变异和丢失。

关键注意事项

1. 技术误差可能导致融合失败，例如，供者淋巴细胞未能产生免疫应答，这将导致实验失败。

2. 融合实验最大的失败原因是污染，因此保证无毒无菌的操作环境，对成功融合至关重要。

在生物医疗领域，掌握细胞融合技术尤其重要，Z6·尊龙凯时致力于为科研工作者提供高质量的科研产品和服务，为推动细胞生物学及相关技术的发展而不懈努力。